Figure 1. Tumor-associated myeloid cells (TAMCs) produce creatine de novo from arginine
使用CD163+磁珠从病人PBMC和组织中提取髓系细胞并进行非靶向代谢组学分析，发现肌酸，鸟苷醋酸酯，磷酸肌酸均发生高表达，并且与放射状胶质细胞基因特征（这是一种与神经胶质瘤干细胞表型和迁移相关的细胞）和经典型，间充质型GBM高度相关。 通过单细胞分析病人组织发现合成肌酸相关的代谢酶GATM和GAMT均在Ma细胞中高表达，且主要和Ma正相关，Ma与肌酸转运SLC6A8负相关。 通过空间转录组学发现，在缺氧signature周围，聚集了一群Ma细胞。
Figure 2. Creatine synthesis and uptake are both spatially and cellularly compartmentalized in the hypoxic niche
通过多色IHC验证栅栏区域富集了Ma而不是小胶质细胞，并在小鼠模型中也验证了。继续使用小鼠单细胞数据验证了Gatm和Slc6a8在髓系细胞和肿瘤细胞中的表达。并且分离了小鼠肿瘤和脾脏，发现肿瘤中arg和gly都显著下调，cre和p-cre显著上调，说明arg和gly被消耗用于合成cre和p-cre。它们的代谢酶和肌酸激酶（CKb）也只在肿瘤中上调，为了提供从头产生肌酸的直接证据，在肿瘤植入14天后从小鼠的肿瘤中分离出CD8+T细胞和TAMC，然后用13C-精氨酸脉冲2小时，检测脾脏和脑中的CD8细胞和Gr1+髓系细胞。发现只有脑中髓系细胞中的cr发生高表达，说明cr在脑部特异。
Figure 3. De novo creatine synthesis is regulated by HIF1a in TAMCs
考虑到这些细胞接近坏死生态位，我们推断低氧血症/酸中毒可能导致这种表型。实验发现在低氧和酸性环境下，qPCR和定量WB都证实了GATM发生高表达，而GAMT不会。由于酸性和缺氧会导致HIF通路激活，所以推测HIF信号通路会对这种表型有影响，siRNA敲除HIF1a后会显著影响gatm表达，而敲除HIF2a不会。
Figure 4. Creatine uptake by GBM is regulated by hypoxia
进一步通过空间转录组，发现GATM在围绕缺氧区域的髓系细胞中高表达，而SLC6A8在缺氧区域表达，通过不同的氧浓度培养，在三种细胞系中验证了缺氧调控了Cre吸收和SLC6A8的表达。通过C13-arg培养Ma发现，C13-cre会显著高表达，说明髓系细胞合成cre，且是脑中的髓系细胞。
Figure 5. Creatine uptake via SLC6A8 by tumor cells promotes cell growth, viability, and tumor progression
为了测试肌酸的摄取是否与GBM的生长和存活相关，我们在正常氧或1%O2缺氧条件下用1mM肌酸激酶处理小鼠CT-2A细胞4小时，并用Cell Titer Glo进行活力测定。在用1mM肌酸处理的缺氧条件下，肿瘤细胞的生存能力显著增加。我们发现，CT-2A肿瘤细胞在缺氧条件下的存活率（通过3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）测定）只有在葡萄糖限制条件下才能提高。通过使用cre抑制剂GPA和肌酸激酶抑制剂均可降低肿瘤细胞生长。在细胞中KO转运蛋白SLC6A8，会使得肿瘤细胞中的cre和GAA显著降低，在敲除SLC6A8的细胞中，2h后即可观察到cre的降低，并且显著降低肿瘤细胞增殖，增加小鼠寿命。
Figure 6. Inhibition of creatine transport perturbs multiple aspects of GBM biology
将TAMC和CT-2A共培养，加入C13-arg，发现在缺氧环境中，cre的合成显著增多，干性分析发现，在缺氧环境中，更低的cre浓度即可增加肿瘤细胞干性，通过GPA药物和放疗联合治疗，小鼠寿命显著延长，GATM-cre小鼠中，Cre和p-cre都显著降低，且寿命增加，Gatm的条件性KO对鸟氨酸和腐胺的产生没有影响，已知它们被TAMC用于在酸性和缺氧肿瘤区域生存。
## Conclusion
Myeloid cells in the hypoxic niche of GBM upregulate de novo creatine biosynthesis.
TAMC-generated creatine is taken up by GBM cells under hypoxic stress.
Creatine uptake by GBM tissue supports its growth, survival, and stem cell phenotypes.
Inhibition of creatine uptake presents a potential therapeutic strategy for GBM.